2022-11-11
目前已知的人類遺傳疾病約60%是由堿基突變引起的，因此開發(fā)高效精準(zhǔn)且安全的單堿基編輯器對基礎(chǔ)研究和人類遺傳疾病的治療具有極為重要的意義。
2022年11月11日，聚焦于基因和細(xì)胞治療的上海邦耀生物科技有限公司（以下簡稱“邦耀生物”）宣布，與華東師范大學(xué)李大力教授、劉明耀教授團(tuán)隊以及北京大學(xué)的伊成器課題組合作發(fā)現(xiàn)了一種可以大幅提升基因編輯準(zhǔn)確性和安全性的技術(shù)。研究團(tuán)隊通過對腺嘌呤脫氨酶TadA-8e重新設(shè)計改造，改變了其對底物的識別和催化，變成僅編輯胞嘧啶的脫氨酶，創(chuàng)新性地開發(fā)了不依賴天然胞嘧啶脫氨酶AID/APOBEC家族的一系列精準(zhǔn)且安全的新型胞嘧啶堿基編輯器——“Td-CGBE/Td-CBEs”(TadA-derived CGBE/CBEs)，與目前最優(yōu)化的胞嘧啶堿基編輯器BE4max相比，展現(xiàn)出了非常低脫靶編輯和indel事件，具備巨大的臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用潛力。該項研究成果已于11月10日正式在國際學(xué)術(shù)期刊Nature Biotechnology上發(fā)表。
Nature Biotechnology發(fā)文
邦耀生物新型胞嘧啶堿基編輯系統(tǒng)：“Td-CGBE/Td-CBEs”臨床應(yīng)用前景廣闊
近年來，隨著CRISPR/Cas9技術(shù)的發(fā)展，單堿基編輯技術(shù)因其高效和精確的基因編輯能力，成為當(dāng)前最有希望治愈各種遺傳疾病的明星工具。
堿基編輯技術(shù)最早由哈佛大學(xué)David R. Liu團(tuán)隊開發(fā)，他們通過將Cas9缺口酶（nickase）與APOBEC家族胞嘧啶脫氨酶以及通過分子進(jìn)化得到的腺嘌呤脫氨酶TadA融合，開發(fā)出可實現(xiàn)C到T堿基轉(zhuǎn)換的胞嘧啶堿基編輯器（Cytosine base editor, CBE）以及A到G堿基轉(zhuǎn)換的腺嘌呤堿基編輯器（Adenine base editor, ABE）。這兩類堿基編輯器能不依賴DNA雙鏈斷裂和同源重組修復(fù)機(jī)制，在分裂及非分裂細(xì)胞基因組DNA上實現(xiàn)高效的堿基轉(zhuǎn)換。目前CBE與ABE雖已在多個物種中得到廣泛應(yīng)用，但通過不少實驗研究表明，它們?nèi)栽诎踩缘确矫娲嬖陔[患。如現(xiàn)有的CBE會產(chǎn)生顯著的不依賴于Cas9的DNA和RNA隨機(jī)脫靶，而且較寬的編輯窗口引起難以避免的旁觀者效應(yīng)。
在本次研究中，科研團(tuán)隊首先證明了ABE尤其是高活性ABE8e可介導(dǎo)高效的胞嘧啶編輯，由此開發(fā)了首款不依賴于天然AID/APOBEC家族酶的CGBE，命名為Td-CGBE（TadA-derived CGBE）。項目組基于結(jié)構(gòu)導(dǎo)向的理性設(shè)計和篩選，發(fā)現(xiàn)在TadA-8e脫氨酶的活性口袋引入關(guān)鍵突變N46L，消除其固有的腺嘌呤脫氨酶活性而展現(xiàn)高效的胞嘧啶編輯活性，隨后在27個靶點（包括4個富含多A的靶點）的測試進(jìn)一步證明了該突變可完全消除腺嘌呤編輯活性，誘導(dǎo)高效率高純度的C到G的轉(zhuǎn)換，效率高達(dá)72.8%。令人驚喜的是，其相對于傳統(tǒng)的CGBE編輯器，該突變體具有更低的indels，且編輯窗口顯著縮窄到1-2個堿基 (C5-C6)。（圖1）
隨后，項目組通過對TadA-8e結(jié)構(gòu)中可能與底物相互作用的關(guān)鍵區(qū)段重新改造、linker序列以及UGI串聯(lián)等多輪優(yōu)化獲得了一系列Td-CBEs，發(fā)現(xiàn)其依然表現(xiàn)為完全消除腺嘌呤編輯的特性，而且產(chǎn)生顯著降低的indels頻率。研究發(fā)現(xiàn)在Td-CBE的基礎(chǔ)上去除linker序列并在TadA-8e-N46L的基礎(chǔ)上引入P29A（eTd-CBEa）或A48M（eTd-CBEm）可保留較高的C到T編輯活性，并且顯著縮小編輯窗口到sgRNA的第5或第6位，與基于APOBEC1來源的窄窗口BE4max-YEE相比，eTd-CBEs變體的精確度最高提升了131.4倍，且僅誘導(dǎo)背景水平的indels事件（圖2）。可以說，Td-CGBE高精確度的特性為進(jìn)一步開發(fā)精準(zhǔn)的C到T的堿基編輯器奠定基礎(chǔ)，能夠解決傳統(tǒng)CBE的精準(zhǔn)性問題。
圖2：Td-CBEs的優(yōu)化及特性評價
此外令人興奮的是，通過Cas9依賴性的脫靶位點、Cas9非依賴性脫靶的R-loop檢測和項目組前期開發(fā)的最靈敏的Detect-seq 以及RNA脫靶的轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，Td-CGBE/Td-CBEs變體幾乎不引起隨機(jī)的DNA和RNA脫靶編輯（圖3），展示出了極高的應(yīng)用安全性。并且Td-CGBE在小鼠胚胎中也表現(xiàn)出極高的體內(nèi)編輯活性和精度。
圖3：Cas9非依賴DNA 脫靶、detect-seq和RNA脫靶評價
為進(jìn)一步評估Td-CGBE/Td-CBEs變體基因治療的潛能和其精準(zhǔn)的特性，研究者評估了其在背景序列含有多個同源多聚胞嘧啶位點的致病單核苷酸變異(SNVs)的編輯情況，這些位點中需要糾正的胞苷處于sgRNA第五位且處于多個連續(xù)胞苷中。發(fā)現(xiàn)Td-CGBE/Td-CBEs能精準(zhǔn)編輯sgRNA第五位的胞苷并產(chǎn)生所需的C-to-G/T轉(zhuǎn)換，相對于傳統(tǒng)CGBE/CBEs展現(xiàn)出更精準(zhǔn)、高效地構(gòu)建或糾正致病 SNVs位點的能力（圖4）。
圖4：Td-BEs變體糾正人類致病性的SNVs及靶向文庫分析無偏見的評價eTd-CBEs編輯特性
論文共同通訊作者，邦耀生物聯(lián)合創(chuàng)始人&副總裁李大力教授表示：“在本次研究中，為了無偏見地分析eTd-CBEs的精準(zhǔn)編輯特性，該研究還采用含有8954條sgRNA與靶點配對的文庫進(jìn)行編輯窗口的分析，證明了其廣泛地精準(zhǔn)編輯特性。并且由于其無編輯序列偏好，將來還可以與識別不同PAM的Cas蛋白變體融合，進(jìn)一步擴(kuò)大靶向范圍?？偟膩碚f，該項研究創(chuàng)造性地通過蛋白改造，將以腺嘌呤為底物的脫氨酶TadA-8e改造成為僅以胞嘧啶為底物的非天然胞嘧啶脫氨酶，并構(gòu)建了第一個不依賴AID/APOBEC 脫氨酶家族的新型胞嘧啶堿基編輯系統(tǒng)，其表現(xiàn)出了與BE4max系列編輯器相當(dāng)?shù)木庉嬓?，并且編輯窗口更加精?zhǔn)，脫靶率極低，接近背景水平。不僅為未來開發(fā)新的堿基編輯技術(shù)提供了新思路，更為重要的是有望極大提高將來臨床應(yīng)用的安全性。”
邦耀生物在單堿基編輯工具開發(fā)領(lǐng)域持續(xù)發(fā)力，助力產(chǎn)品全面布局
作為一家全球最早進(jìn)行基因編輯技術(shù)研發(fā)和應(yīng)用的企業(yè)之一，邦耀生物自2013年成立以來，一直堅持技術(shù)創(chuàng)新，不僅不斷克服行業(yè)壁壘進(jìn)行多管線戰(zhàn)略布局，同時致力于開發(fā)國際領(lǐng)先的基因編輯工具，獲得具有自主知識產(chǎn)權(quán)的核心技術(shù)。
目前，邦耀生物科學(xué)家團(tuán)隊在基因編輯工具開發(fā)、基因治療地中海貧血以及CAR-T技術(shù)創(chuàng)新領(lǐng)域，已經(jīng)取得很多重磅、突破性進(jìn)展。近1年來，邦耀生物已在國際著名學(xué)術(shù)期刊Nature、Nature Medicine、Nature Biotechnology、Nature Chemical Biology等發(fā)表多篇學(xué)術(shù)論文，特別是在單堿基編輯工具開發(fā)領(lǐng)域的相繼突破，為基礎(chǔ)研究和遺傳性疾病如β-地中海貧血的治療提供了新的發(fā)展方向和工具。
對此，論文共同通訊作者，邦耀生物創(chuàng)始人&董事長劉明耀教授表示，“本次高精度新型胞嘧啶堿基編輯系統(tǒng)‘Td-CGBE/Td-CBEs’的開發(fā)，是邦耀生物繼開發(fā)出ABE9新型腺嘌呤堿基編輯器后在單堿基編輯工具開發(fā)領(lǐng)域的又一次革命性創(chuàng)新。此次堿基編輯器的優(yōu)化升級及安全性的完善，為人類遺傳疾病的基因治療帶來了新希望。而邦耀生物作為一家細(xì)胞基因藥企，一直以來都注重在底層基因編輯技術(shù)方面不斷探索，著眼于基因藥物和細(xì)胞藥物的開發(fā)。目前，邦耀生物已與國內(nèi)多家醫(yī)療單位合作，在基因編輯治療β-地中海貧血癥、非病毒PD1定點整合CAR-T、以及UCART等項目中已經(jīng)取得優(yōu)異臨床效果。未來，邦耀生物仍將依托堅實的基礎(chǔ)研發(fā)實力，不斷地加速推進(jìn)創(chuàng)新藥物的轉(zhuǎn)化與落地，造福全球遺傳疾病、惡性腫瘤及自身免疫系統(tǒng)疾病等患者；并致力于改寫和引領(lǐng)中國新一代藥企在全球生命科技領(lǐng)域格局！”
