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2020-05-11
2020年5月11日，上海邦耀生物科技有限公司（下稱邦耀生物）與華東師范大學(xué)密切合作，為打破現(xiàn)有堿基編輯技術(shù)效率瓶頸，通過(guò)融合單鏈DNA結(jié)合蛋白的功能域開(kāi)發(fā)了一系列超高活性的新型胞嘧啶堿基編輯器（命名為：hyCBE）。相對(duì)于已報(bào)道的CBE，在人類細(xì)胞系及小鼠胚胎中其活性均顯著提高并可以編輯到靠近PAM區(qū)的堿基。更令人振奮的是，活性的提高并沒(méi)有增加DNA及RNA脫靶風(fēng)險(xiǎn)，并且在基因治療等表現(xiàn)出非常廣闊的應(yīng)用前景。相關(guān)成果于2020年5月11日在線發(fā)表于國(guó)際著名學(xué)術(shù)期刊Nature Cell Biology。這也是邦耀生物繼發(fā)表在 Cell Research、Nature Medicine 等期刊的基因治療重磅成果后，在基因編輯領(lǐng)域開(kāi)發(fā)核心堿基編輯工具的開(kāi)篇之作。
據(jù)ClinVar數(shù)據(jù)顯示，人類的遺傳病中58%是由于單個(gè)堿基突變引起的。雖然Cas9激活的同源重組可以實(shí)現(xiàn)對(duì)突變位點(diǎn)的精確修正，但效率非常低（0.1%~5%），嚴(yán)重阻礙了其應(yīng)用。而通過(guò)將胞嘧啶脫氨酶與nickase Cas9（D10A）融合而成的胞嘧啶堿基編輯器BE3(Cytosine base editor, CBE),在不引入DNA雙鏈斷裂同時(shí)也不需要重組修復(fù)模板的情況下對(duì)編輯窗口（距離PAM遠(yuǎn)端起的第4-7位）內(nèi)的胞嘧啶脫氨，實(shí)現(xiàn)C>T的堿基轉(zhuǎn)換，具有更加安全、高效、精準(zhǔn)的特點(diǎn)。在基因治療，農(nóng)作物遺傳育種，藥物篩選等領(lǐng)域展示了廣泛的應(yīng)用前景。
自CBE被報(bào)道以來(lái)，已有多種策略對(duì)其進(jìn)行了優(yōu)化改進(jìn)。例如在提高活性方面，主要是通過(guò)密碼子優(yōu)化及增加更強(qiáng)的核定位信號(hào)、用高活性的胞嘧啶脫氨酶APOBEC3A或Anc689替換APOBEC1、融合額外的UGI增加編輯效率和產(chǎn)物純度。而通過(guò)對(duì)脫氨酶的分子進(jìn)化獲得的evoAPOBEC1-BE4max大幅提高針對(duì)GC motif中胞嘧啶的編輯效率。雖然這些方法一定程度上提高了CBE的活性，但是對(duì)于編輯窗口的影響不大，特別是更靠近PAM序列的堿基仍然很難被編輯到。因此，是否有新的策略可以提高編輯活性而又能擴(kuò)增靶向堿基的范圍，一直是堿基編輯器優(yōu)化的難點(diǎn)。
由于CBE主要是以單鏈DNA（ssDNA）為底物，因此研究團(tuán)隊(duì)猜測(cè)如果增強(qiáng)脫氨酶與ssDNA的結(jié)合能力，是否能增加脫氨酶作用時(shí)間而增強(qiáng)活性呢？于是，通過(guò)對(duì)10個(gè)非序列特異性的ssDNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（ssDBD）與CBE進(jìn)行融合，通過(guò)篩選，發(fā)現(xiàn)將Rad51蛋白的ssDBD融合到APOBEC1與Cas9n之間能顯著提高堿基編輯活性，同時(shí)編輯窗口也大幅增加（圖1）。通過(guò)10個(gè)靶點(diǎn)的分析，在編輯窗口C4-C8中，hyBE4max比BE4max活性提高了1.5-2倍，而在C9-C15這些更靠近PAM的堿基中，活性最多提高了18倍。
圖1. hyCBE模式圖及對(duì)不同ssDBD的篩選結(jié)果
為了驗(yàn)證融合ssDBD的策略是否具有通用性，用類似的方法改造A3A-BE4max和特異性識(shí)別TC motif中C堿基的eA3A-BE4max,獲得了hyA3A-BE4max和hyeA3A-BE4max。通過(guò)大量的實(shí)驗(yàn)證明，相比A3A-BE4max，hyA3A-BE4max活性在C3-C11位點(diǎn)提高了1.2-2倍，C12-C17位點(diǎn)活性提高3-4倍，通過(guò)小鼠胚胎顯微注射也進(jìn)一步證明其在編輯更靠近PAM序列的堿基的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。與eA3A-BE4max相比，hyeA3A-BE4max仍然能非常特異性地靶向TC motif中的C，編輯窗口由C4-C9拓展為C4-C15，活性最高提高了257倍；而在小鼠胚胎中靶向Dmd基因時(shí)，C13位點(diǎn)編輯效率也大大提高，F(xiàn)0小鼠平均編輯活性提高了近60倍，F(xiàn)0代小鼠獲得Dmd純合點(diǎn)突變的效率達(dá)到40%。
論文進(jìn)一步驗(yàn)證hyCBEs特別是hyeA3A沒(méi)有檢測(cè)到DNA或者RNA層面的脫靶，具有非常高的精準(zhǔn)性。最后，通過(guò)比較多種CBE在編輯胎兒血紅蛋白（HBG1/2）啟動(dòng)子-117位點(diǎn)的能力發(fā)現(xiàn)，hyeA3A能在紅細(xì)胞前體細(xì)胞系中精確催化-117G>A的轉(zhuǎn)換，而與周?chē)瑫r(shí)發(fā)生堿基突變（bystander mutation）的細(xì)胞相比，具有更高的HBG表達(dá)水平，展示了hyeA3A-BE4max對(duì)于精準(zhǔn)治療β-血紅蛋白病的巨大潛力。該工作開(kāi)發(fā)了能提高編輯活性及拓寬靶點(diǎn)范圍的一系列新的CBE，為基礎(chǔ)研究與基因治療提供了新的優(yōu)化工具。
據(jù)了解，今年1月份，劉明耀教授和李大力教授團(tuán)隊(duì)已經(jīng)率先證明單堿基編輯器編輯技術(shù)靶向HBG啟動(dòng)子激活胎兒期血紅蛋白的表達(dá)，對(duì)于治療β地中海貧血的可行性與有效性，相關(guān)研究發(fā)表在國(guó)際著名學(xué)術(shù)期刊Cell Research；同年3月份國(guó)際著名學(xué)術(shù)期刊Nature Medicine又在線發(fā)表了邦耀生物科學(xué)家吳宇軒博士證明單堿基編輯技術(shù)可以靶向BCL11A的紅系增強(qiáng)子原件激活胎兒期血紅蛋白，或者編輯β血紅蛋白基因的特定突變，有望通過(guò)編輯自體造血干細(xì)胞治療包括β地貧在內(nèi)的β血紅蛋白病。而最新自主研發(fā)的hyCBEs系列工具擁有更高的編輯活性和更寬的編輯窗口，對(duì)于β血紅蛋白病的治療具有更大的優(yōu)勢(shì)。邦耀生物正著力圍繞這幾項(xiàng)自主技術(shù)開(kāi)展臨床轉(zhuǎn)化。
據(jù)統(tǒng)計(jì)，在我國(guó)β-地中海貧血的患病率是2.21%，其類型達(dá)48種?；蚓庉嫾夹g(shù)介導(dǎo)的基因治療是精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的一大突破，利用單堿基編輯技術(shù)重新激活胎兒血紅蛋白的表達(dá)，也為β-地中海貧血的個(gè)性化治療提供了可能性。
邦耀生物聯(lián)合創(chuàng)始人、總裁席在喜先生透露：邦耀生物已搭建了創(chuàng)新、高效的基因編輯平臺(tái)，今天開(kāi)發(fā)的超高活性的單堿基編輯器將會(huì)為基因治療再添利器，邦耀生物著眼于基因藥物和細(xì)胞藥物的開(kāi)發(fā)，目前已與國(guó)內(nèi)多家醫(yī)療單位合作，在遺傳疾病及惡性腫瘤的研究中取得了階段性突破。除堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)研發(fā)實(shí)力外，邦耀生物還擁有經(jīng)驗(yàn)豐富的工藝研發(fā)與生產(chǎn)團(tuán)隊(duì)及6000平米GMP級(jí)別中試基地，能夠?qū)?chuàng)新成果及時(shí)迅速進(jìn)行轉(zhuǎn)化并推向臨床！邦耀生物布局于劃時(shí)代的基因與細(xì)胞藥物領(lǐng)域，并致力于改寫(xiě)和引領(lǐng)中國(guó)新一代藥企在全球生命科技領(lǐng)域格局！
