2020-06-12
在已知的6 000多種遺傳病中, 目前只有大約5%的疾病可以通過小分子藥物或酶替代療法進(jìn)行治療，超過95%的遺傳疾病無有效的治療方案, 治愈更是無從談起?；蛑委煘檫z傳疾病帶來了希望，尤其對于單基因罕見病，基因治療提供了一種從根本上治愈遺傳疾病的可能，即僅需一次治療就可以達(dá)到終身治愈的目的。近幾年來基因編輯技術(shù)的快速發(fā)展，迎來了一個全新的時代，以CRISPR/Cas9、單堿基編輯、CART等技術(shù)引領(lǐng)的產(chǎn)業(yè)變革越來越烈，讓我們看到這些新興技術(shù)的巨大潛力，并激發(fā)了無限的機(jī)遇。
邦耀生物自2013年成立以來，一直聚焦于基因編輯和基因治療領(lǐng)域，經(jīng)過幾年發(fā)展，基于基因編輯和基因治療的技術(shù)正在不斷取得各種突破并逐步走向成熟。特別是近1年來，邦耀已在國際著名學(xué)術(shù)期刊Nature Biotechnology、Nature Medicine、Nature Cell Biology、Cell Research等發(fā)表多篇學(xué)術(shù)論文，特別是在單堿基編輯工具開發(fā)領(lǐng)域的相繼突破，為基礎(chǔ)研究和遺傳性疾病如β-地中海貧血的治療提供了新的發(fā)展方向和工具。
目前邦耀已自主研發(fā)并成功搭建起基因治療技術(shù)轉(zhuǎn)化平臺，并且在基因編輯和基因治療領(lǐng)域已經(jīng)遞交30余項全球及中國專利申請。其中，基因治療β-地中海貧血的產(chǎn)品管線，邦耀生物采用了具有自主知識產(chǎn)權(quán)的基因編輯技術(shù)重新開啟胎兒期的γ珠蛋白的表達(dá)，代替有缺陷的β珠蛋白的治療方案，可以有效緩解地貧癥狀，是一種更為高效、便捷、安全且成本極低的治療手段，具有很大的臨床轉(zhuǎn)化潛力。該項目正與國內(nèi)多家頂級醫(yī)療單位攜手，希望借此項研究及其臨床實驗的推廣，使得基于基因編輯的基因治療成為我國β-地中海貧血患者全新的臨床治療方案，并有望實現(xiàn)“一次治療終身治愈”的療效。
值得一提的是，除了重點布局在地中海貧血的產(chǎn)品管線，邦耀也正在積極拓展其他遺傳疾病領(lǐng)域。2020年5月，邦耀生物科學(xué)家劉明耀教授及李大力教授團(tuán)隊，先后在基因治療和腎臟疾病頂級雜志Molecular Therapy和Kidney International發(fā)文，表明基因治療在I型酪氨酸血癥、I型原發(fā)性高草酸尿癥等遺傳疾病中的巨大潛力。
2020年5月7日，基因治療頂級雜志Molecular Therapy在線發(fā)表了題為“Amelioration of an Inherited Metabolic Liver Disease through Creation of a De Novo Start Codon by Cytidine Base Editing”的研究論文。該研究利用重組腺相關(guān)病毒（rAAV）遞送拆分型胞嘧啶單堿基編輯工具BE4max，成功治愈了Ⅰ型酪氨酸血癥（HTⅠ）小鼠。該研究首次開創(chuàng)性地利用單堿基編輯技術(shù)在小鼠基因組上引入功能性元件來治療遺傳疾病，通過單堿基編輯在起始密碼子突變的延胡索酰乙酰乙酸水解酶（Fah）基因的5’UTR引入一個全新的起始密碼子，重新開啟該基因的表達(dá)，成功治愈了因缺失該酶而出現(xiàn)嚴(yán)重肝損傷的HTⅠ小鼠。華東師范大學(xué)楊磊，王立人和霍雅楠為本文共同第一作者。
I型酪氨酸血癥
Ⅰ型酪氨酸血癥（HTⅠ）是一種罕見的常染色體隱性遺傳疾病，由于缺失酪氨酸代謝途徑中最后一步反應(yīng)所需的延胡索酰乙酰乙酸水解酶（FAH），使得酪氨酸代謝受阻，導(dǎo)致延胡索酰乙酰乙酸（Fumarylacetoacetate，F(xiàn)AA）、馬來酰乙酰乙酸（Maleylacetoacetate，MAA）和琥珀酰丙酮（Succinylacetone，SA）等有毒代謝產(chǎn)物的積累，造成嚴(yán)重的肝腎損傷。目前HTⅠ的發(fā)病率為1/12000到1/100000之間, 若不給予任何治療，患兒通常在一歲內(nèi)就會死亡。
現(xiàn)有療法的缺陷：
目前，服用羥基苯丙酮酸雙加氧酶（4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase）的抑制劑尼替西農(nóng)（NTBC）是臨床上最有效的治療方法。雖然NTBC為HTⅠ 病人提供了有效的治療，但有研究表明TNBC會影響兒童的智商，學(xué)習(xí)和社會認(rèn)知能力。
本技術(shù)方案優(yōu)勢：
ClinVar 數(shù)據(jù)顯示，人類約58%的遺傳疾病是由點突變引起的，需要通過堿基轉(zhuǎn)換來進(jìn)行修復(fù)，而HTⅠ幾乎全是由點突變導(dǎo)致，單堿基編輯技術(shù)的出現(xiàn)為治療HTⅠ和其他由點突變引起的遺傳疾病提供了一個全新的策略。HTⅠ是一個理想的基因治療模型，被修復(fù)的肝細(xì)胞具有強(qiáng)大的生長優(yōu)勢，因此，只需要修復(fù)一小部分肝細(xì)胞，在不給予NBCT治療的情況下，這些肝細(xì)胞就會不斷擴(kuò)增，最終形成一個全新的健康的肝臟。
圖1：治療策略示意圖
在體外實驗中，研究人員利用胞嘧啶單堿基編輯工具BE4max靶向HTⅠ小鼠（FahNS/NS）Fah基因突變的起始密碼子（G1TG3），但由于G1和G3都位于BE4max的編輯窗口內(nèi)，導(dǎo)致G1和G3同時被編輯，不能有效形成正常的起始密碼子（A1TG3）。為了解決這一問題，研究者另辟蹊徑，利用BE4max靶向Fah基因的5’UTR區(qū)域，試圖將距突變的起始密碼子上游12bp處的G-12TG-10轉(zhuǎn)變?yōu)橐粋€全新的起始密碼子（A-12TG-10），在該位點中，G-12位于BE4max的編輯窗口內(nèi)，但G-10在編輯窗口外，經(jīng)編輯可以高效地形成起始密碼子(圖1)。采用這種策略，研究人員利用rAAV遞送拆分型BE4max到FahNS/NS小鼠肝臟，在不撤去NTBC藥水的情況下，編輯效率可高達(dá)14%，撤藥治療兩個月后編輯效率可高達(dá)40%，同時肝損傷得到顯著緩解（圖2）。
圖2：血清肝功能指標(biāo)檢測
通過檢測預(yù)測的10個脫靶位點，沒有發(fā)現(xiàn)脫靶編輯。該研究表明單堿基編輯工具可以通過rAAV遞送到肝臟并進(jìn)行高效編輯，同時，通過單獨引入一個起始密碼子可以用于治療由起始密碼子突變而導(dǎo)致的遺傳疾病。
二、基因療法可以有效緩解Ⅰ型原發(fā)性高草酸尿癥
2020年5月25日，華東師范大學(xué)李大力教授團(tuán)隊和上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院耿紅全團(tuán)隊合作在Kidney International發(fā)文，利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)對Ⅰ型原發(fā)性高草酸尿癥（PH1）大鼠進(jìn)行代謝通路重編程，通過阻止上游Hao1基因的表達(dá)有效降低尿草酸水平，長期有效地緩解疾病表征。值得一提的是，該研究報道的動物模型是一種新的PH1大鼠模型, 在部分人源化的AGXT基因中攜帶D205N突變，出生后不久即表現(xiàn)出明顯的高草酸和結(jié)晶尿等疾病表征，相比原有的小鼠與人類PH1疾病表現(xiàn)更加接近。上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院鄭銳，李約延和華東師范大學(xué)王立人為本文共同第一作者。
Ⅰ型原發(fā)性高草酸尿癥（PH1）
I型原發(fā)性高草酸尿癥是常染色體隱性遺傳疾病，由于患者體內(nèi)編碼丙氨酸/乙醛酸轉(zhuǎn)氨酶（AGT）的AGXT基因突變所致的肝細(xì)胞內(nèi)代謝異常。正常AGXT基因編碼的AGT蛋白負(fù)責(zé)將乙醛酸催化成甘氨酸，AGXT的突變導(dǎo)致患者肝細(xì)胞內(nèi)的乙醛酸無法被正常代謝，致使大量堆積的乙醛酸被氧化成草酸進(jìn)入血液循環(huán)。高濃度的草酸導(dǎo)致腎臟和尿路結(jié)石，造成泌尿系統(tǒng)梗阻、腎臟損傷和終末期腎?。‥SRD），超過50%的PH1患者在30歲以前進(jìn)展為終末期腎病。
現(xiàn)有療法的缺陷：
該病目前無特效藥，保守治療效果極差，雖然肝腎聯(lián)合移植可以根治PH1，但器官供體缺乏、終身服用抗排異藥物、手術(shù)創(chuàng)傷極大等因素使得絕大多數(shù)PH1患者無法得到根治性治療。先后有研究團(tuán)隊在PH1小鼠模型（Agxt-/-）中注射載有AGXT基因的腺相關(guān)病毒（AAV）或腺病毒（Adv）進(jìn)行基因治療，草酸水平在短期內(nèi)顯著下降，但隨著患者肝臟細(xì)胞的分裂、更新，最初遞送的外源AGXT基因會逐漸丟失，治療效果也會隨之下降。需要短時間內(nèi)重復(fù)治療。另有研究顯示通過SiRNA沉默乙醛酸的上游反應(yīng)酶體乙醇酸氧化酶（由HAO1基因編碼）可以有效切斷PH1小鼠體內(nèi)的乙醛酸來源進(jìn)而降低小鼠體內(nèi)草酸水平，但該療法同樣需要重復(fù)給藥。
本技術(shù)方案優(yōu)勢：
相比siRNA技術(shù)和基因替代療法，CRISPR/Cas9技術(shù)能夠更高效持久地敲除體內(nèi)的HAO1基因，免去了患者長期反復(fù)用藥的負(fù)擔(dān)。首先通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)產(chǎn)生一個新的PH1大鼠模型，該模型在部分人源化的Agxt基因中攜帶D205N突變。AgxtD205N突變大鼠AGT蛋白表達(dá)缺失，在乙二醇負(fù)荷后1個月內(nèi)出現(xiàn)高草酸尿，腎臟草酸鈣(CaOx)沉積嚴(yán)重，提示新模型相比原有的小鼠模型與人類疾病的相關(guān)性更強(qiáng)。
為了驗證該模型是否可用于創(chuàng)新療法的開發(fā)，研究人員通過AAV載體將靶向乙醇酸氧化酶的CRISPR/Cas9系統(tǒng)遞送到新生PH1大鼠體內(nèi)。結(jié)果顯示該策略在肝臟的HAO1基因中產(chǎn)生了30%的編輯效率，在12個月的研究周期內(nèi)，治療組的尿草酸水平比對照組降低了42%，并防止了PH1大鼠形成嚴(yán)重的腎草酸鈣沉積。以上結(jié)果表明，這種部分人源化的AgxtD205N大鼠不僅是了解PH1病理機(jī)制的合適模型，而且能用于更多創(chuàng)新療法的開發(fā)（例如文中所展示的通過基因編輯重新編程代謝途徑）。
基因治療一直被認(rèn)為是最有可能從根本上治愈遺傳疾病的解決方案，根據(jù)2019年發(fā)布的報告，預(yù)計在未來六年內(nèi)，將有大約60種基因療法產(chǎn)品獲批，這些藥物的銷售額在2024年將達(dá)到146億美元，約占全球醫(yī)藥總收入的1.2%，可見未來基因治療罕見病的廣泛應(yīng)用前景。
邦耀生物自成立以來，一直放眼全球，全面布局基因治療領(lǐng)域，除了重點布局基因治療β-地中海貧血癥之外，同時也重點關(guān)注酪氨酸血癥、血友病等多種罕見遺傳病，未來邦耀將持續(xù)通過掌握核心技術(shù)以及生產(chǎn)能力來保證在這一賽道的競爭力，如不斷優(yōu)化新型基因治療技術(shù)(編輯工具、治療基因的改造)，及新型基因遞送載體的組合治療，早日為遺傳疾病患者帶來福音。
附原文鏈接：
1. Yang L, Wang L, Huo Y, et al. Amelioration of an Inherited Metabolic Liver Disease through Creation of a De Novo Start Codon by Cytidine Base Editing [published online ahead of print, 2020 May 7]. Mol Ther. 2020;S1525-0016(20)30235-5. doi:10.1016/j.ymthe.2020.05.001
2. Zheng R, Li Y, Wang L, et al. CRISPR/Cas9-mediated metabolic pathway reprogramming in a novel humanized rat model ameliorates primary hyperoxaluria type 1 [published online ahead of print, 2020 May 25]. Kidney Int. 2020;S0085-2538(20)30554-8. doi:10.1016/j.kint.2020.04.049
