2019-03-26
前言
2019年3月25日，國際著名學(xué)術(shù)期刊《Nature Medicine》在線發(fā)表了邦耀科學(xué)家吳宇軒研究員在基因治療方向的題為“Highly efficient therapeutic gene editing of human hematopoietic stem cells”的研究成果[1]。華東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院吳宇軒研究員和哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院及波士頓兒童醫(yī)院曾靜是該論文的共同第一作者。該研究證實通過CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)有望徹底根治由β-globin珠蛋白突變引發(fā)的系列遺傳疾病。
一、研究背景
β-地中海貧血是一種由于β-珠蛋白(β-globin)亞基突變導(dǎo)致患者自身的成人血紅蛋白(HbA)異常的遺傳性疾病。鐮刀狀貧血(SCD)與β-地貧致病機(jī)理類似，都是β亞基突變導(dǎo)致的單基因遺傳性疾病，主要癥狀為：HbA結(jié)構(gòu)異常，紅細(xì)胞變形，出現(xiàn)典型的鐮刀形狀，無法有效通過微循環(huán)，運(yùn)輸氧能力降低，出現(xiàn)貧血。不過鐮刀狀貧血在國內(nèi)患者很少，主要發(fā)生在黑色人種中，在非洲黑人中的發(fā)病率最高，在我國的南方地區(qū)也發(fā)現(xiàn)有少數(shù)病例。
《中國地中海貧血防治藍(lán)皮書(2015)》的數(shù)據(jù)顯示，目前我國“地貧”基因攜帶者約3000萬人，涉及近3000萬家庭一億人口，中度至重癥地貧患者約30萬人且正以每年約10％的速度遞增。我國以南方地區(qū)多見，廣西以12.22%～23.02%地中海貧血基因高攜帶率居我國首位，其次廣東、海南等省。
治療方式有限，急待新興療法出現(xiàn)
地中海貧血根據(jù)病情輕重，可以分為三類：輕度、中度和重度。通常情況下，輕型“地貧”無需特殊治療。中間型和重型“地貧”主要采取以下方式：除鐵治療、輸血治療、骨髓造血干細(xì)胞異體移植、脾切除手術(shù)等。
其中，異體造血干細(xì)胞移植是根治“地貧”的方法，但費(fèi)用花費(fèi)巨大，且配型極其困難；其他方法只能夠維持“地貧”患者生命，同樣給家庭帶來極大經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，且需消耗大量血液資源，患者生活質(zhì)量極低，不能從源頭上根治該疾病。
基因療法有望成為新的治療選擇
近年來，基因療法的出現(xiàn)給患者帶來了希望，其最大的優(yōu)勢在于不需要捐贈，不需要異體移植，而且一次治療可能導(dǎo)致永久性的“治愈”，有望取代目前并不完美的治療方案。
目前，針對地中海貧血的基因治療策略主要分為兩種，基于慢病毒整合的方式和基于基因編輯的方式。策略為：遞送功能性β-血紅蛋白基因拷貝或基因編輯組分至患者的造血干細(xì)胞(HSC)，從此替病變的β-血紅蛋白基因完成工作。
基于慢病毒整合
針對慢病毒整合，進(jìn)展速度最快的是Bluebird Bio基因療法LentiGlobin，針對輸血依賴性β-地中海貧血癥(TDT)和鐮刀狀貧血(SCD)的臨床試驗分別進(jìn)行到III期和I/II期，已獲得EMA的加速審評資格并且已向EMA提交了上市許可申請，有望于2019年率先在歐洲上市。
LentiGlobin是一種基于慢病毒載體的體外基因療法，該療法雖表現(xiàn)出極大的潛力，但是半隨機(jī)的載體整合方式，具有致癌風(fēng)險；同時慢病毒中的表達(dá)原件在造血干細(xì)胞長期歸巢和自我更新的過程中會逐漸沉默，使得療效下降，極有可能無法達(dá)到終身治愈的目的。并且這種方法需要大量病毒，即意味著巨額的花費(fèi)花費(fèi)較高。
基于基因編輯
對比基于慢病毒整合的方式，基于基因編輯技術(shù)的基因療法成為了一種可能成本更低、耐久性更佳的治療手段。
在歐洲，CRISPR Therapeutics/Vertex公司利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的在研基因療法CTX001用于治療TDT正處于I/II期臨床試驗中，這也是首個由制藥公司發(fā)起的CRISPR臨床試驗，并且是歐盟批準(zhǔn)的首個。2018年10月，美國FDA批準(zhǔn)CTX001用于嚴(yán)重SCD的臨床試驗申請。
2019年2月25日，兩家公司宣布第一名TDT患者已在I/II期臨床研究中接受CTX001治療。與此同時，它們正在研究用于治療SCD的CTX001，并宣布第一名嚴(yán)重SCD患者已在美國參加I/II期臨床研究，預(yù)計將在2019年中期輸注CTX001。
不同于靶向?qū)е录膊〉娜毕莼颍?/span>CTX001通過切割一種抑制胎兒血紅蛋白(HbF)表達(dá)的BCL11A基因起作用，HbF是一種可以攜帶大量氧的血紅蛋白，通常在出生時表達(dá)，成年后被置換為成人血紅蛋白(HbA)。在體外，CTX001通過電穿孔引入患者自體造血干細(xì)胞，然后回輸?shù)交颊唧w內(nèi)，可以產(chǎn)生含有高水平HbF的紅細(xì)胞，代替HbA起作用。
二、治療機(jī)理
研究發(fā)現(xiàn)，胎兒血紅蛋白HbF其構(gòu)成為(α2γ2)，γ-globin具有和β-globin相似的功能，并且編碼該蛋白的基因HBG在貧血患者中序列完好，但到成年期表達(dá)便會被沉默。因此，重新激活患者體內(nèi)γ-globin基因的表達(dá)來彌補(bǔ)缺損的β-globin，被認(rèn)為是治療或緩解這類遺傳性貧血的一個重要策略。
基因編輯(Genome editing)技術(shù)能夠通過插入、缺失或替換的手段對基因組進(jìn)行定點(diǎn)改造，能讓正?；蛱鎿Q突變基因，從而利用基因編輯技術(shù)重新開啟胎兒期的γ珠蛋白的表達(dá)，代替有缺陷的β珠蛋白，因此很有可能成為緩解甚至治愈地貧的治療方法。
BCL11A基因的表達(dá)與γ-球蛋白表達(dá)成負(fù)相關(guān)，提示在患者造血干細(xì)胞中靶向編輯BCL11A紅系增強(qiáng)子會重新激活HbF的表達(dá)，再將高效編輯后的造血干細(xì)胞移植給患者重建造血，可產(chǎn)生高表達(dá)HbF的紅細(xì)胞，且不會影響淋巴細(xì)胞的分化、成熟[2-5]?；诖耍厦嫣岬降腃RISPR Therapeutics/Vertex也正在進(jìn)行體外基因療法的臨床試驗。
三、研究結(jié)果
基因治療地貧示意圖[6]
基于上述機(jī)理，最新研究首先通過比較不同的sgRNA優(yōu)化編輯系統(tǒng)，實現(xiàn)了CRISPR/Cas9核糖核蛋白(RNP)在人CD34+造血干/祖細(xì)胞中的高效基因編輯。接著，將編輯過后的CD34+細(xì)胞體外紅系分化后，發(fā)現(xiàn)BCL11A的表達(dá)水平顯著降低，同時HbF的含量得到極大提升。
對多種地中海貧血類型的患者來源CD34+細(xì)胞進(jìn)行編輯的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，分化后的紅細(xì)胞分化更加成熟、體積和形態(tài)都恢復(fù)至接近于健康細(xì)胞水平。
研究人員通過進(jìn)一步優(yōu)化Cas9原核表達(dá)載體和編輯系統(tǒng)，使得CD34+細(xì)胞在體外的編輯效率進(jìn)一步提高到了98%，這樣就可以使得CD34+細(xì)胞中的長期造血干細(xì)胞(LT-HSCs)得到有效編輯。
基因編輯的造血干移植小鼠體內(nèi)后，可以顯著提高紅細(xì)胞的HbF水平
編輯后的造血干細(xì)胞移植至免疫缺陷小鼠體內(nèi)4個月后仍然保持著90%以上的編輯效率，并且能在小鼠骨髓中成功重建人源血液系統(tǒng)，同時分化得到的紅細(xì)胞含有高比例的HbF。另外，研究發(fā)現(xiàn)人長期造血干細(xì)胞LT-HSCs在被Cas9編輯后更傾向于被非同源末端連接(NHEJ)的方式修復(fù)，而非微同源末端連接(MMEJ)。
小鼠體內(nèi)γ-globin表達(dá)水平在編輯前后對比
SCD患者的細(xì)胞編輯后，HbF水平提升且細(xì)胞恢復(fù)正常形態(tài)
最后，研究人員證明了鐮刀狀貧血病(SCD)人來源的CD34+細(xì)胞也能被高效編輯且在編輯后移植至小鼠體內(nèi)重建人源血液系統(tǒng)，同時紅細(xì)胞中HbF的提升水平足以幫助細(xì)胞恢復(fù)正常形態(tài)，抵抗鐮刀化。
SCD來源CD34+細(xì)胞編輯后可抵抗鐮刀化
深度測序發(fā)現(xiàn)，Cas9 RNP介導(dǎo)的基因編輯是一種極其安全的治療方法
此外，研究人員還用CIRCLE-seq鑒定了一批潛在脫靶位點(diǎn)，并對潛在的脫靶位點(diǎn)和上百個可能的白血病突變位點(diǎn)進(jìn)行了深度測序，結(jié)果顯示這些位點(diǎn)并沒有出現(xiàn)異常的插入或缺失，證實了Cas9 RNP介導(dǎo)的CD34+細(xì)胞中的基因編輯是一種極其安全的治療策略。
CIRCLE-seq和深度測序鑒定和分析脫靶位點(diǎn)
四、臨床意義
體外“地貧”患者造血干細(xì)胞、老鼠疾病模型、靈長類疾病模型等數(shù)據(jù)均顯示對“地貧”疾病的徹底治愈完全有效。大量臨床數(shù)據(jù)顯示，HbF只需達(dá)到血紅蛋白總量的30%，即可完全治愈地中海貧血疾病，而此策略（通過CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)編輯β-地中海貧血和鐮刀狀貧血患者造血干細(xì)胞中的BCL11A增強(qiáng)子位點(diǎn)，并進(jìn)行自體造血干細(xì)胞移植）所產(chǎn)生的HbF比例高達(dá)40%，因此足以起到治療效果，從而有可能根治此類疾病。
與在基因治療方面處于領(lǐng)先地位的BlueBird Bio公司的慢病毒療法（名為LentiGlobin療法正處于臨床3期）相比，該論文的方法只需要在體外將Cas9蛋白和sgRNA通過電轉(zhuǎn)染被導(dǎo)入患者自體造血干細(xì)胞，然后將其回輸?shù)交颊唧w內(nèi)，編輯后的造血干細(xì)胞可以分化為含有高水平HbF的紅細(xì)胞，從而治療血紅蛋白相關(guān)的遺傳疾病。
五、成果轉(zhuǎn)化
綜上所述，CRISPR/Cas9技術(shù)的出現(xiàn)使得我們可以通過重新開啟胎兒期的γ珠蛋白的表達(dá)，從而代替有缺陷的β珠蛋白，達(dá)到緩解地貧癥狀的目的，具有很大的臨床轉(zhuǎn)化潛力。另外，目前國內(nèi)還沒有利用此方法治療地中海貧血的臨床實驗，因此有望成為世界首批進(jìn)入臨床階段的基因編輯治療產(chǎn)品。
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